血必净对兔急性肺损伤的早期保护作用及其机制(2)
1.3.3.4 肺组织NF-κB、MMP-9 mRNA表达水平测定采用RT-PCR法。取右肺上叶肺组织样本,称重,剪碎,液氮研磨,加入1ml Trizol匀浆于4℃、12 000r/min离心10min。采用Trizol法获取总RNA,逆转录成cDNA,再行荧光定量PCR反应。实验采用相对定量研究法法进行分析,分析采取的指标为:2-ΔΔCt。实验使用的上游引物序列为:5′-TGGTCAGCTCCCTTCTCTGT-3′,下游引物为:5′-TACCTCCAGCCTGCTTCTGT-3′。相关方法步骤严格参照说明书进行。
1.3.3.5 肺组织病理学观察 肺组织用10%甲醛固定,石蜡包埋,切片4~5μm厚,HE染色,光镜下观察其病理改变。并采用Smith肺损伤病理评分[7]进行评价:没有损伤为0分;轻度损伤、间质水肿和局限性坏死、病变范围<25%为1分;中度损伤、广泛的肺脏细胞肿胀和坏死、或病变范围25%~50%为2分;严重损伤、有毛细血管内皮肿胀、细胞间隙增宽、大量炎性细胞浸润和肺脏萎缩的坏死,或病变范围51%~75%为3分;极严重的损伤、弥漫性血管损伤、出血和肺脏坏死,或病变范围76%~100%为4分。累加每组家兔的分数,并计算出平均分值,分值越高提示该组家兔炎症病变程度越重。
1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 5 组家兔血清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 含量及肺 W/D 值比较 L、H、D、A 组 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10及W/D值均比N组高(均P<0.05);L、H、D组TNF-α、IL-1β、IL-6及W/D值均比A组低,其中H组降低最明显,差异均有统计学意义(均P<0.05);而L、H 、D组IL-10含量均高于A组,其中H组升高明显,差异均有统计学意义(均P<0.05),见表 1。
2.2 5组家兔肺组织NF-κB、MMP-9蛋白表达水平比较 肺组织NF-κB、MMP-9蛋白表达水平以A组最高,而L、D、H组依次降低,H组降低最显著,见图1。
2.3 5组家兔肺组织NF-κB、MMP-9 mRNA表达水平的比较 L、H、D、A 组 NF-κB、MMP-9 mRNA 的表达水平均比N组高(均P<0.05),L、H、D组则均比A组低,其中以H组降低最明显,差异均有统计学意义(均P<0.05),见图 2、表 2。
2.4 5组家兔肺组织病理变化 N组未见明显改变,其余各组肉眼可见肺体积变大,表面散在瘀斑,部分组织切面可见红色实样变,伴有泡沫样渗出。光镜下见肺泡壁充血,间质水肿,肺泡腔相对狭窄,伴炎症细胞浸润,可见出血、渗出等。L、H、D组较A组改变相对较轻,其炎性浸润等较少、且肺泡壁充血相对改善,其中以H组改善最明显,差异均有统计学意义(均P<0.05),见表3、图3。
3 讨论
实验前,各组家兔呼吸、心率等生命体征均平稳,无烦躁不安、意识异常等情况。爆炸致伤后,各组家兔呼吸浅快,活动后出现呼吸窘迫、点头呼吸等现象,口唇等皮肤黏膜相继出现发绀,口鼻分泌物增多,肺部听诊有明显湿啰音,甚至少数家兔出现短暂昏迷,提示出现呼吸功能不全。爆炸致伤后,肉眼可见家兔肺体积变大,表面散在瘀斑,部分组织切面可见红色实样变,切面可伴有泡沫样渗出。光镜下见肺泡壁充血,间质水肿,肺泡腔相对狭窄,伴炎症细胞浸润,可见出血、渗出等。爆炸损伤肺实质、肺间质,引起多种炎症细胞的反应、炎性介质释放、血管通透性改变,肺顺应性改变等,进而引起肺通气血流比例失调,出现呼吸困难等现象。L、D、H、A组均出现以上现象,但以H组改变相对最轻。本实验显示,爆炸后各组家兔呼吸加快、呼吸困难、烦躁不安,口鼻分泌物增多,昏迷,肺部啰音等,W/D比值明显升高,血气PaO2/FiO2≤300mmHg,且肺病理学改变符合ALI病理变化标准,提示造模成功、有效[8]。
ALI发病机制复杂,肺或全身炎症反应失控被认为是ALI/ARDS的主要发病机制。爆炸伤后,炎症介质尤其是TNF-α、IL-1、IL-6等“早期反应细胞因子”大量释放,从而诱发炎症级联反应。其中促炎细胞因子(主要包括 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等)和抗炎细胞因子(主要有IL-4、IL-10、IL-1受体拮抗剂等)失衡在发病过程中起重要作用[9]。IL-1β在ALI发病中能诱导中性粒细胞和单核/巨噬细胞趋化,产生多种趋化因子如IL-8、MCP-1等,最终导致炎症浸润。而TNF-α能诱导白细胞迁移、粒细胞脱颗粒、肺内皮细胞活化、和毛细血管渗透性增加,促进水肿液形成,影响肺泡气体交换,造成低氧血症等;此外,TNF-α还与其他细胞因子形成作用网络促进ALI的发生、发展[10]。而IL-10是一个以免疫抑制为主的多向免疫调节因子,其主要生物活性表现为直接抑制炎症细胞活化,可抑制IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF 等表达[11]。实验结果显示,造模成功后,L、H、D、A组血清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 表达均比 N 组高;A组TNF-α、IL-1β、IL-6表达均高于 L、D、H 组;而 A 组IL-10的表达低于L、D、H组;其中均以H组变化最明显。提示TNF-α、IL-1β、IL-6是ALI重要的促炎介质,而IL-10在体内发挥着重要的抗炎作用,且血必净、地塞米松对肺损伤都有保护作用,但以H组最明显。
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